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實時熒光定量pcr分析儀百科知識
發布時間:2025-07-16 09:29:55

實時熒光定量PCR分析儀

定義
實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)分析儀是一種用于在DNA擴增過程中實時監測熒光信號的高精度分子生物學儀器。它結合了傳統PCR的核酸擴增能力與熒光檢測技術,可對起始模板DNA/RNA進行精確定量、基因表達分析、病原體檢測等,是分子診斷、基因研究的核心設備。


核心工作原理

  1. PCR擴增基礎

    • 通過溫度循環(變性→退火→延伸)在體外指數級擴增特定DNA片段。

  2. 熒光標記與檢測

    • 熒光探針/染料:在反應體系中加入熒光標記物(如SYBR Green、TaqMan探針),其熒光強度與PCR產物量成正比。

    • 實時監測:每完成一次擴增循環,儀器通過光學系統檢測熒光信號,生成擴增曲線。

  3. 定量原理

    • Ct值(循環閾值):熒光信號達到設定閾值時的循環數。Ct值與起始模板量成反比(模板越多,Ct值越小)。

    • 標準曲線法:通過已知濃度的標準品建立Ct值-濃度對數曲線,計算未知樣本濃度。


儀器核心結構

組件功能
熱循環模塊精確控制溫度(±0.1℃),實現快速升降溫(可達6℃/秒)。
光學檢測系統多通道熒光檢測器(常見4-6色),激發/發射濾光片切換,采集熒光信號。
反應模塊96孔/384孔反應板,兼容多種耗材(如0.2mL管、多聯管)。
控制系統軟件驅動:設置程序(溫度、時間)、熒光通道、數據采集頻率。
數據分析軟件自動計算Ct值、基因表達量(ΔΔCt法)、熔解曲線分析、生成標準曲線等。

關鍵技術類型

  1. 熒光化學方法

    • 莖環結構探針,僅與靶序列結合時發熒光,背景噪音低。

    • 探針含報告/淬滅基團,擴增時水解釋放熒光,特異性極高。

    • 結合雙鏈DNA發熒光,成本低,但可能結合非特異產物(需熔解曲線驗證)。

    • SYBR Green I:

    • 水解探針(TaqMan):

    • 分子信標(Molecular Beacon):

  2. 多重檢測能力

    • 多色熒光通道可同時檢測多個靶基因(如病原體分型、內參基因校正)。


核心應用領域

領域應用場景
病原體檢測病毒(如SARS-CoV-2、HIV)、細菌、真菌的快速定量診斷。
基因表達分析mRNA表達量測定(比較不同組織/藥物處理下的基因差異)。
基因分型與突變檢測SNP分型、基因編輯(CRISPR)效率驗證、癌癥驅動突變篩查。
轉基因檢測食品/作物中轉基因成分定量。
microRNA研究短鏈RNA定量(需特殊逆轉錄步驟)。
藥物研發藥效基因靶點表達調控分析。

操作流程

  1. 樣本準備:提取DNA/RNA → 逆轉錄(RNA樣本)。

  2. 反應體系配制:引物/探針、熒光染料、模板、聚合酶混合。

  3. 程序設置:

    • 預變性(95℃, 30s)→ 循環擴增(95℃變性, 5s → 60℃退火/延伸, 30s, 40次)→ 熔解曲線分析(60℃→95℃)。

  4. 數據分析:

    • 軟件自動生成擴增曲線、熔解曲線、標準曲線,計算基因相對表達量(2<sup>-ΔΔCt</sup>)。


優勢與局限

優勢局限性
高靈敏度(可檢測單拷貝基因)易受抑制劑影響(血色素、肝素等)
寬動態范圍(跨越7-10個數量級)引物/探針設計不當易導致假陰性
閉管操作,污染風險低設備與試劑成本較高
快速(1-2小時完成檢測)需嚴格防RNA降解(基因表達分析時)
支持絕對定量與相對定量依賴標準曲線(絕對定量需標準品)

關鍵性能參數

  • 溫控精度:±0.1℃(確保擴增特異性)。

  • 檢測通道數:決定多重檢測能力(常見4-6通道)。

  • 升降溫速率:>5℃/秒可縮短反應時間。

  • 靈敏度:可檢測低至1-10拷貝的模板。

  • 通量:96孔板(中通量)vs. 384孔板(高通量)。


發展趨勢

  1. 數字化PCR(dPCR):

    • 將樣本分割為微滴,實現絕對定量無需標準曲線,精度更高。

  2. 便攜式qPCR儀:

    • 現場快速檢測(如機場、田間病原體篩查)。

  3. 自動化整合:

    • 與核酸提取儀、液體處理工作站聯用,全流程無人操作。

  4. 多重檢測升級:

    • 16色以上通道,單次檢測數十種靶標。


使用注意事項

  • 防污染措施:

    • 分區操作(試劑準備區→樣本處理區→擴增區),使用UNG酶防殘留污染。

  • 質控設置:

    • 陰性對照(無模板)、陽性對照、內參基因(如GAPDH)。

  • 熔解曲線驗證(SYBR Green法):

    • 確保擴增產物單一,無非特異峰。


總結

實時熒光定量PCR分析儀憑借其高靈敏度、定量準確性和操作便捷性,已成為分子診斷與生命科學研究的基石設備。從新冠疫情中的病毒載量監測,到癌癥基因的精準分型,其應用深度持續拓展。隨著數字化、便攜化與自動化技術的融合,qPCR技術將繼續推動精準醫療與即時檢測的發展。

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